細(xì)胞色素C是一類(lèi)含有鐵啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B 和細(xì)胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個(gè)重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個(gè)血紅素和一條多肽鏈?，F(xiàn)已從許多來(lái)源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶，并已對(duì)100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定。
細(xì)胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶，廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運(yùn)動(dòng)的肌肉中含量zui為豐富。細(xì)胞色素C 位于線粒體的蛋白質(zhì)—脂質(zhì)絡(luò)合物中，分子量約為13000，肽鏈中含有19個(gè)賴(lài)氨酸殘基，為一堿性蛋白, 等電點(diǎn)（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉，它是一種陽(yáng)離子交換劑，細(xì)胞色素C分子剛好進(jìn)入它的表面空隙。在pH7.5時(shí)細(xì)胞色素C 呈正電荷，它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換，從而被沸石吸附。裝入層析柱后，用25%硫酸銨洗脫，又可將細(xì)胞色素C 交換下來(lái)。硫酸銨主要是降低沸石對(duì)細(xì)胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細(xì)胞色素C 純度，主要為去除雜蛋白。另外三氯乙酸可引起細(xì)胞色素C 變性和聚合，必須嚴(yán)格控制三氯乙酸用量。
細(xì)胞色素C與材料試劑
1、 設(shè)備：組織搗碎機(jī)、酸度計(jì)、離心機(jī)、分光光度計(jì)、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
2、 儀器：剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
3、 試劑：聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、三氯乙酸、人造沸石、氯化鋇、氯化鈉、氫氧化銨。
4、 材料：新鮮豬心（2個(gè)）。
細(xì)胞色素C實(shí)驗(yàn)步驟
1、預(yù)處理：健康豬心去脂肪等結(jié)締組織—→剪碎放入碎冰中（保護(hù)酶的活性，避免搗碎機(jī)破碎時(shí)使酶失活）—→放入生理鹽水中清洗去污—→稱(chēng)重：燒杯80g ，燒杯＋豬心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→組織搗碎機(jī)勻漿10min （勻漿3min ，停5min ，為了保證搗碎機(jī)安全）
2、提取：攪拌后靜置2h —→四層紗布過(guò)濾后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在過(guò)濾后靜置2h —→放入冰箱保存過(guò)夜—→從冰箱中取出—→加2mol/L氨水調(diào)PH 至6.0，靜置30min ，過(guò)濾—→濾液加2mol/L氨水調(diào)PH 至7.5，靜置30min, 過(guò)濾
3、吸附：加10%人造沸石（濾液為220ml ）—→磁力攪拌器攪拌吸附1h —→蒸餾水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→濾出人造沸石待用
4、洗脫：在柱中裝人造沸石體積的三分之二蒸餾水—→將沸石放入柱中—→裝滿(mǎn)25%硫酸銨溶液進(jìn)行洗脫，流速控制在2ml/min 以下, 收集紅色的洗脫液（沒(méi)分辨出紅色液體階段，收集了所有洗脫液）
5、鹽析：在洗脫液（300ml ）中慢慢加入固體硫酸銨75g, 邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液的濃度為50%—→置4℃冰箱過(guò)夜—→過(guò)濾，收集濾液—→向過(guò)濾液中按22ml/L的量滴加濃度為20%的三氯乙酸溶液（過(guò)濾液和20%三氯乙酸溶液在4℃遇冷, 邊加邊攪拌, 加時(shí)要快, 防止局部蛋白質(zhì)變性）—→加完后分成8管，立即離心—→無(wú)明顯沉淀，再5000轉(zhuǎn)離心15min —→無(wú)明顯沉淀，向每只離心管加入2滴濃度為20%的三氯乙酸溶液—→再5000轉(zhuǎn)離心15min —→無(wú)明顯沉淀，實(shí)驗(yàn)結(jié)束
6、透析 將上述溶解后的細(xì)胞色素C 裝入透析袋中, 放進(jìn)500ml 燒杯中（用磁力攪拌器攪拌），用去離子水透析, 除去硫酸根離子，15min 換水一次，換手3~4次后，檢查硫酸根離子是否已被除盡。檢查方法：取2ml 氯化鋇溶液加入試管中，滴加2~3滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示硫酸根離子未除盡，如果不出現(xiàn)沉淀，表示透析*。將透析液過(guò)濾， 收集濾液即為細(xì)胞色素C 粗品。 記錄此粗品的體積。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/div>
1、通過(guò)細(xì)胞色素C的制備，了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟
2、掌握制備細(xì)胞色素C的操作技術(shù)及含量的測(cè)定方法
實(shí)驗(yàn)原理：
細(xì)胞色素是一類(lèi)含有鐵啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B和細(xì)胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個(gè)重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個(gè)血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來(lái)源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶，并已對(duì)100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定。
結(jié)果表明，細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來(lái)源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴(lài)氨酸含量較高，等電點(diǎn)為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。
細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對(duì)熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2，100℃加熱3分鐘，細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時(shí)間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對(duì)酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長(zhǎng)時(shí)間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的，因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。
細(xì)胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶，廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運(yùn)動(dòng)的肌肉中含量zui為豐富。細(xì)胞色素C 位于線粒體的蛋白質(zhì)—脂質(zhì)絡(luò)合物中，分子量約為13000，肽鏈中含有19個(gè)賴(lài)氨酸殘基，為一堿性蛋白, 等電點(diǎn)（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉，它是一種陽(yáng)離子交換劑，細(xì)胞色素C 分子剛好進(jìn)入它的表面空隙。在pH7.5時(shí)細(xì)胞色素C 呈正電荷，它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換，從而被沸石吸附。裝入層析柱后，用25%硫酸銨洗脫，又可將細(xì)胞色素C 交換下來(lái)。硫酸銨主要是降低沸石對(duì)細(xì)胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細(xì)胞色素C 純度，主要為去除雜蛋白。另外乙酸可引起細(xì)胞色素C 變性和聚合，必須嚴(yán)格控制酸用量。
細(xì)胞色素C與材料試劑
1、 設(shè)備：組織搗碎機(jī)、酸度計(jì)、離心機(jī)、分光光度計(jì)、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
2、 儀器：剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
3、 試劑：聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、、人造沸石、氫氧化銨。
4、 材料：新鮮豬心（2個(gè)）。
結(jié)果表明，細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來(lái)源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴(lài)氨酸含量較高，等電點(diǎn)為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對(duì)熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘，細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時(shí)間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對(duì)酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長(zhǎng)時(shí)間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的，因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。
細(xì)胞色素C不是根據(jù)輔基來(lái)命名；與其他三類(lèi)細(xì)胞色素非共價(jià)結(jié)合血紅素不同的是，細(xì)胞色素c通過(guò)分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價(jià)結(jié)合。細(xì)胞色素e尚無(wú)，但有細(xì)胞色素f（細(xì)胞色素c中的一種）。[3]此外，細(xì)胞色素d僅存在于細(xì)菌中。
掃一掃，關(guān)注微信
當(dāng)前位置：